Mesoscopic 3D Quantitative Imaging: Attenuation Correction with OPTiSPIM

Abstract

This thesis covers a number of technical developments, to improve mesoscopic imaging and analysis, with a focus on quantitative imaging. The main topic is attenuation in light sheet fluorescence microscopies (LSFM). Attenuation can be a prominent part of signal deterioration, however none of the presented technical improvements in LSFM address this problem directly.

We address the problem by fusing optical projection tomography (OPT) with selective plane illumination microscopy (SPIM) in a hybrid setup (OPTiSPIM). In contrast to SPIM, that relys on fluorescent contrast, OPT can reconstruct data from absorbing contrast.

Apart from having registered multimodal datasets by fusing data from different contrast mechanisms, the reconstructed absorption contrast provides a 3D attenuation map to the sample. This map is not accessible with a single SPIM scan, but allows for correcting the deterioration of the fluorescent SPIM signal. The corrected signal provides a more accurate measure of fluorescence in the sample.

Aquesta tesi cobreix una sèrie de desenvolupaments tècnics, per a millorar l’adquisició i l’anàlisi d’imatges mesoscòpiques, centrant-se en l’obtenció quantitativa d’imatges. El tema principal és l’atenuació en microscòpia de làmina de llum fluorescent (LSFM). L’atenuació pot ser una causa important en el deteriorament de la senyal, tot i que cap de les millores tècniques existents en LSFM anaven adreçades a aquest problema directament.

Hem abordat aquest problema mitjançant la fusió de la tomografia de projecció òptica (OPT) amb la microscòpia de pla d’il.luminació selectiva (SPIM) en un únic aparell híbrid (OPTiSPIM). A diferència de l’SPIM, que es basa en contrast de fluorescència, l’OPT permet recontruir dades del contrast d’absorbància.

A part d’haver registrat dades multimodals mitjançant la fusió de dades de diferents mecanismes de contrast, el contrast d’absorció reconstruït obté un mapa d’atenuació en 3D de la mostra que permet la correcció del deteriorament de la senyal fluorescent obtinguda amb l’SPIM. Aquesta senyal corregida permet una mesura més acurada de la fluorescència de la mostra.