Providing growth-decoupled strategies for recombinant protein production in Komagataella phaffii: from promoter identification to bioprocess scale-up

Abstract

Komagaella phaffii s'ha convertit en els últims anys en la factoria cel·lular de llevat preferida per a la producció de proteïnes recombinants i biomolècules. Per a desenvolupar un nou bioprocés es requereixen principalment dues fases: la generació de la soca heteròloga i la optimització del procés de producció, també conegut com enginyeria de bioprocessos. No obstant, per ara només la primera etapa ha estat àmpliament estudiada en K. phaffii. En l'enginyeria de bioprocessos, és de vital importància que les condicions de cultiu s’adaptin al promotor seleccionat, que és qui dirigeix l'expressió de la proteïna recombinant. Per evitar l'ús de metanol i promoure una regulació més independent de la font de carboni, promotors alternatius desreprimits i/o desacoblats al creixement han guanyat molta rellevància últimament, com ara el promotor ortòleg PDF. Per tant, aquesta tesi s'ha centrat en la identificació de promotors desacoblats al creixement i lliures de metanol, així com en el desenvolupament d'estratègies de cultiu innovadores que exprimeixin al màxim el potencial del promotor. Com a objectiu final es trobava l’aplicació dels coneixements adquirits per tal de desenvolupar un bioprocés escalable per a la producció d’una peroxigenasa inespecífica (UPO, per les seves sigles en anglès). El promotor PDH es va identificar mitjançant l’anàlisi transcriptòmic de cultius en erlenmeyer en condicions de manca de repressió per font de carboni. A partir de cultius preliminars, es va observar que el promotor PDH es trobava altament activat en condicions de restricció severa de carboni. D’acord amb això, es va dissenyar una estratègia en bioreactor desacoblada al creixement, realitzant una primera fase de cultiu en fed-batch a una velocitat específica de creixement alta, amb l’objectiu d’aconseguir densitats cel·lulars mitjanes. A continuació, es va aplicar una restricció severa de la font de carboni a base de mantenir un cabal d’alimentació constant molt baix, obtenint les anomenades condicions de pseudo-fam. Tot i que la biomassa no va augmentar en aquesta segona fase, la producció de la lipasa B de Candida antarctica (CalB) va incrementar notablement, duplicant els nivells de CalB produïts per una soca basada en el clàssic promotor GAP. A causa de la rellevància de la regulació de PDH, es van dur a terme dues campanyes d'enginyeria de promotors per augmentar-ne la força. Com a resultat, MV1 i MV2 es van eregir com les millors variants per a l'expressió de CalB en cultius en erlenmeyer, gairebé doblant la producció de CalB en comparació amb la soca basada en PDH. Un cop enxamplat el nombre de promotors desacoblats al creixement disponibles per K. phaffii (PDH, MV1, MV2 i PDF), es van realitzar cultius en bioreactor empreant diferents estratègies d'alimentació amb glucosa, glicerol i metanol, estudiant com afecta la restricció de carboni a la producció de CalB. En tots els cultius, PDF va mostrar els nivells de producció més alts, a banda d'una millor robustesa i reproducibilitat, fet que el va convertir en el promotor seleccionat per a escalar a planta pilot el procés de producció d'una UPO. A més, l'anàlisi transcripcional de 26 gens va permetre la identificazció de 12 gens regulats positivament en condicions de pseudo-fam, suggerint que els seus promotors serien bons candidats per conduir l'expressió de proteïnes recombinants. Es va fer un canvi d'escala d'un factor de 100 vegades en la producció de la UPO d'Hypoxylon sp. EC38 (HspUPO), mantenint els mateixos nivells de producció que a escala laboratori, a més de dos processos de recuperació del producte. En total es van escalar exitosament dos processos amb diferents estratègies d'alimentació sense metanol, prèviament dissenyades al laboratori. La millor de les dues condicions va registrar la productivitat d'UPO més alta mai reportada.

Komagaella phaffii se ha convertido en los últimos años en la factoría celular de levadura preferida para la producción de proteínas recombinantes y biomoléculas. Para desarrollar un nuevo bioproceso se requieren principalmente dos fases: la generación de la cepa heteróloga y la optimización del proceso de producción, también conocida como ingeniería de bioprocesos. No obstante, por ahora solo se ha estudiado ampliamente la primera etapa en K. phaffii. En la ingeniería de bioprocesos, es de vital importancia que las condiciones de cultivo se adapten al promotor seleccionado, que es el encargado de dirigir la expresión de la proteína recombinante. Para evitar el uso de metanol y promover una regulación más independiente de la fuente de carbono, promotores alternativos desreprimidos y/o desacoplados del crecimiento han ganado mucha relevancia últimamente, como el promotor ortólogo PDF. Por lo tanto, esta tesis se ha centrado en la identificación de promotores desacoplados al crecimiento y libres de metanol, así como en el desarrollo de estrategias de cultivo innovadoras que exploten al máximo el potencial del promotor. Como objetivo final estaba la aplicación de los conocimientos adquiridos para desarrollar un bioproceso escalable para la producción de una peroxigenasa inespecífica (UPO, por sus siglas en inglés). El promotor PDH se identificó mediante el análisis transcriptómico de cultivos en erlenmeyer en condiciones de falta de represión por fuente de carbono. A partir de cultivos preliminares, se observó que el promotor PDH se encontraba altamente activado en condiciones de restricción severa de carbono. En concordancia con esto, se diseñó una estrategia en biorreactor desacoplada del crecimiento, realizando una primera fase de cultivo en fed-batch a una velocidad específica de crecimiento alta, con el objetivo de alcanzar densidades celulares medias. A continuación, se aplicó una restricción severa de la fuente de carbono mediante un flujo de alimentación constante muy bajo, obteniendo las llamadas condiciones de pseudo-hambre. Aunque la biomasa no aumentó en esta segunda fase, la producción de la lipasa B de Candida antarctica (CalB) aumentó notablemente, duplicando los niveles de CalB producidos por una cepa basada en el clásico promotor GAP. Debido a la relevancia de la regulación de PDH, se llevaron a cabo dos campañas de ingeniería de promotores para aumentar su fuerza. Como resultado, MV1 y MV2 se erigieron como las mejores variantes para la expresión de CalB en cultivos en erlenmeyer, casi duplicando la producción de CalB en comparación con la cepa basada en PDH. Una vez ampliado el número de promotores desacoplados del crecimiento disponibles para K. phaffii (PDH, MV1, MV2 y PDF), se realizaron cultivos en biorreactor empleando diferentes estrategias de alimentación con glucosa, glicerol y metanol, estudiando cómo afecta la restricción de carbono a la producción de CalB. En todos los cultivos, PDF mostró los niveles de producción más altos, además de una mejor robustez y reproducibilidad, lo que lo convirtió en el promotor seleccionado para escalar a planta piloto el proceso de producción de una UPO. Además, el análisis transcripcional de 26 genes permitió la identificación de 12 genes regulados positivamente en condiciones de pseudo-hambre, sugiriendo que sus promotores serían buenos candidatos para dirigir la expresión de proteínas recombinantes. Se realizó un cambio de escala de un factor de 100 veces en la producción de la UPO de Hypoxylon sp. EC38 (HspUPO), manteniendo los mismos niveles de producción que a escala de laboratorio, además de dos procesos de recuperación del producto. En total, se escalaron exitosamente dos procesos con diferentes estrategias de alimentación sin metanol, previamente diseñadas en el laboratorio. La mejor de las dos condiciones registró la productividad de UPO más alta jamás reportada.

Komagaella phaffii has become the preferred yeast cell factory for recombinant protein and biomolecule production in recent years. Developing a new bioprocess mainly requires two phases: the generation of the heterologous strain and the optimization of the production process, also known as bioprocess engineering. However, so far only the first stage has been extensively studied in K. phaffii. In bioprocess engineering, it is crucial that the cultivation conditions are adapted to the selected promoter, which drives the expression of the recombinant protein. To avoid the use of methanol and promote more a carbon-source-independent regulation, alternative derepressed and/or growth-decoupled promoters have recently gained much relevance, such as the orthologous PDF promoter. Therefore, this thesis has focused on the identification of growth-decoupled and methanol-free promoters, as well as the development of innovative cultivation strategies to fully exploit the promoter's potential. The final goal was to apply the acquired knowledge to develop a scalable bioprocess for the production of an unspecific peroxygenase (UPO). The PDH promoter was identified through transcriptomic analysis of shake-flask cultivations under de-repressed conditions. Preliminary cultures showed that the PDH promoter was highly activated under severe carbon restriction conditions. Accordingly, a growth-decoupled bioreactor strategy was designed, performing first a fed-batch phase at a high specific growth rate to achieve medium cell densities. Then, a severe carbon source restriction was applied by maintaining a very low constant feeding rate, resulting in the so-called pseudo-starving conditions. Although biomass did not increase in this second phase, the production of Candida antarctica lipase B (CalB) remarkably increased, doubling the CalB levels produced by a strain based on the classic GAP promoter. Due to the relevance of PDH regulation, two promoter engineering campaigns were carried out to increase its strength. As a result, MV1 and MV2 emerged as the best variants for CalB expression in shale-flask cultivations, nearly doubling CalB production compared to the PDH-based strain. After expandint the number of growth-decoupled promoters available for K. phaffii (PDH, MV1, MV2, and PDF), bioreactor cultivations were conducted using different feeding strategies with glucose, glycerol, and methanol, studying the effects of carbon restriction to CalB production. In all cultures, PDF showed the highest production levels, as well as better robustness and reproducibility, becoming the selected promoter for scaling up an UPO production process to pilot plant level. Additionally, the transcriptional analysis of 26 genes enabled the identification of 12 genes up-regulated under pseudo-starvating conditions, suggesting that their promoters would be promising candidates to drive recombinant protein expression. Finally, a 100-fold scale-up of the production bioprocess of the UPO from Hypoxylon sp. EC38 (HspUPO) was carried out, maintaining the same production levels as at the laboratory scale, besides two downstream campaigns. In total, two cultivations with different methanol-free feeding strategies, previously designed in the lab, were successfully scaled up. The best of the two conditions obtained the highest UPO productivity ever reported.