Biofilms de listeria monocytogenes y salmonella enterica en instalaciones alimentarias: desarrollo de estrategias para el control de ambos patógenos

Abstract

La innocuïtat alimentària és una prioritat fonamental a la indústria alimentària, ja que garanteix que els aliments siguin segurs per al consum humà i estiguin lliures d'agents patògens que puguin causar malalties. Tot i això, la contaminació creuada continua sent una de les principals amenaces per a la seguretat alimentària, ja que facilita la propagació de microorganismes entre diferents aliments, superfícies i utensilis de treball. Aquesta contaminació és particularment problemàtica quan involucra patògens com Listeria monocytogenes i Salmonella enterica. Tots dos microorganismes són capaços de formar biofilms en superfícies alimentàries. Aquestes estructures dificulten lacció dels desinfectants convencionals.

El desenvolupament de biofilms en superfícies alimentàries representa un desafiament per a la indústria alimentària. Els mètodes tradicionals de neteja i desinfecció no sempre són efectius per a la seva eradicació total, cosa que fa que la prevenció i el control d'aquests biofilms sigui una tasca crucial. En resposta a aquest desafiament, s'han començat a desenvolupar estratègies alternatives que incloguin l'ús d'olis essencials i mètodes de biocontrol com a solucions emergents per prevenir i eliminar la formació de biofilms. Els olis essencials han demostrat posseir propietats antimicrobianes naturals que poden ser efectives contra una àmplia gamma de patògens alimentaris. D'altra banda, el biocontrol mitjançant la introducció de microorganismes no patògens que competeixen amb patògens per nutrients o espai, o que produeixen compostos antimicrobians específics, es perfila com una altra estratègia innovadora.

Amb l'objectiu de desenvolupar noves estratègies per al control de biofilms de L. monocytogenes i S. enterica en superfícies alimentàries, primer es va caracteritzar la capacitat de formació, la composició macromolecular i l'arquitectura dels biofilms d'ambdues espècies. Els resultats van mostrar que els dos bacteris tenen una capacitat notable per formar biofilms sobre superfícies d'acer inoxidable. Pel que fa a la composició de la matriu del biofilm, es va observar un predomini de proteïnes en tots dos casos. Les representacions 3D de l'arquitectura dels biofilms van revelar una distribució irregular i desorganitzada dels components de la matriu.

Posteriorment, sobre la base dels resultats preliminars abans descrits, es van dissenyar estratègies amb l'objectiu de prevenir i eliminar aquests biofilms. Com a primer enfocament, es va avaluar l'efectivitat antimicrobiana de diversos olis essencials per seleccionar el més adequat per al seu ús combinat amb enzims. Entre els olis avaluats, l'oli essencial de casia va demostrar ser el més efectiu contra L. monocytogenes i S. enterica. Alhora, es va determinar que l'aplicació de dosis subinhibitòries d'oli essencial de casia va reduir la tolerància a l'efecte antimicrobià en diversos ceps, sent L. monocytogenes ST-388 i S. Typhimurium CECT 4594 les que van mostrar les reduccions més grans. Així mateix, de manera general, es va observar un canvi limitat en el perfil de sensibilitat dels ceps avaluats als antibiòtics després de l'exposició a l'oli essencial de casia.

A partir d'aquests resultats, es van avaluar vuit tractaments que combinaven diferents enzims (proteasa, amilasa i mananasa) amb oli essencial de casia per determinar la millor estratègia d'eliminació de biofilms madurs. La combinació de proteasa, amilasa i oli essencial de casia es va seleccionar com la més efectiva. Els resultats quantitatius i qualitatius van demostrar que aquest tractament va aconseguir reduccions als recomptes cel·lulars propers al 100%, a més de disgregar l'arquitectura del biofilm.

Finalment, com a segona estratègia va ser el biocontrol, es va avaluar la capacitat de Bacillus safensis per reemplaçar ecològicament L. monocytogenes i S. enterica en superfícies d'acer inoxidable. La presència de biofilms preformats de B. safensis va reduir significativament els recomptes dels dos patògens en biofilms biespècie, sent L. monocytogenes el més afectat, cosa que el perfila com un competidor feble davant B. safensis.

La inocuidad alimentaria es una prioridad fundamental en la industria alimentaria, ya que garantiza que los alimentos sean seguros para el consumo humano y estén libres de agentes patógenos que puedan causar enfermedades. Sin embargo, la contaminación cruzada sigue siendo una de las principales amenazas para la seguridad alimentaria, ya que facilita la propagación de microorganismos entre distintos alimentos, superficies y utensilios de trabajo. Esta contaminación es particularmente problemática cuando involucra patógenos como Listeria monocytogenes y Salmonella enterica. Ambos microorganismos son capaces de formar biofilms en superficies alimentarias. Estas estructuras dificultan la acción de los desinfectantes convencionales.

El desarrollo de biofilms en superficies alimentarias representa un desafío para la industria alimentaria. Los métodos tradicionales de limpieza y desinfección no siempre son efectivos para su erradicación total, lo que hace que la prevención y control de estos biofilms sea una tarea crucial. En respuesta a este desafío, se han comenzado a desarrollar estrategias alternativas que incluyan el uso de aceites esenciales y métodos de biocontrol como soluciones emergentes para prevenir y eliminar la formación de biofilms. Los aceites esenciales han demostrado poseer propiedades antimicrobianas naturales que pueden ser efectivas contra una amplia gama de patógenos alimentarios. Por otro lado, el biocontrol mediante la introducción de microorganismos no patógenos que compiten con patógenos por nutrientes o espacio, o que producen compuestos antimicrobianos específicos, se perfila como otra estrategia innovadora.

Con el objetivo de desarrollar nuevas estrategias para el control de biofilms de L. monocytogenes y S. enterica en superficies alimentarias, se procedió primero a caracterizar la capacidad de formación, la composición macromolecular y la arquitectura de los biofilms de ambas especies. Los resultados mostraron que ambas bacterias tienen una notable capacidad para formar biofilms sobre superficies de acero inoxidable. En cuanto a la composición de la matriz del biofilm, se observó un predominio de proteínas en ambos casos. Las representaciones 3D de la arquitectura de los biofilms revelaron una distribución irregular y desorganizada de los componentes de la matriz.

Posteriormente, en base a los resultados preliminares antes descritos se diseñaron estrategias con el objetivo de prevenir y eliminar estos biofilms. Como primer enfoque, se evaluó la efectividad antimicrobiana de varios aceites esenciales para seleccionar el más adecuado para su uso combinado con enzimas. Entre los aceites evaluados, el aceite esencial de casia demostró ser el más efectivo contra L. monocytogenes y S. enterica. A su vez, se determinó que la aplicación de dosis subinhibitorias de aceite esencial de casia redujo la tolerancia al efecto antimicrobiano en varias cepas, siendo L. monocytogenes ST-388 y S. Typhimurium CECT 4594 las que mostraron las mayores reducciones. Asimismo, de forma general, se observó un cambio limitado en el perfil de sensibilidad de las cepas evaluadas a los antibióticos tras la exposición al aceite esencial de casia.

A partir de estos resultados, se evaluaron ocho tratamientos que combinaban distintas enzimas (proteasa, amilasa y mananasa) con aceite esencial de casia para determinar la mejor estrategia de eliminación de biofilms maduros. La combinación de proteasa, amilasa y aceite esencial de casia se seleccionó como la más efectiva. Los resultados cuantitativos y cualitativos demostraron que este tratamiento logró reducciones en los recuentos celulares cercanos al 100%, además de disgregar la arquitectura del biofilm.

Finalmente, como segunda estrategia fue el biocontrol, se evaluó la capacidad de Bacillus safensis para reemplazar ecológicamente a L. monocytogenes y S. enterica en superficies de acero inoxidable. La presencia de biofilms preformados de B. safensis redujo significativamente los recuentos de ambos patógenos en biofilms biespecie, siendo L. monocytogenes el más afectado, lo que lo perfila como un competidor débil frente a B. safensis.

Food safety is a key priority in the food industry, ensuring that food is safe for human consumption and free of pathogens that can cause disease. However, cross-contamination remains one of the main threats to food safety, as it facilitates the spread of microorganisms between different foods, surfaces and work utensils. This contamination is particularly problematic when it involves pathogens such as Listeria monocytogenes and Salmonella enterica. Both microorganisms are capable of forming biofilms on food surfaces. These structures hinder the action of conventional disinfectants.

The development of biofilms on food surfaces represents a challenge for the food industry. Traditional cleaning and disinfection methods are not always effective in completely eradicating them, making the prevention and control of these biofilms a crucial task. In response to this challenge, alternative strategies have begun to be developed that include the use of essential oils and biocontrol methods as emerging solutions to prevent and eliminate the formation of biofilms. Essential oils have been shown to possess natural antimicrobial properties that can be effective against a wide range of food pathogens. On the other hand, biocontrol through the introduction of non-pathogenic microorganisms that compete with pathogens for nutrients or space, or that produce specific antimicrobial compounds, is emerging as another innovative strategy.

In order to develop new strategies for the control of biofilms of L. monocytogenes and S. enterica on food surfaces, the formation capacity, macromolecular composition and architecture of the biofilms of both species were first characterized. The results showed that both bacteria have a remarkable capacity to form biofilms on stainless steel surfaces. Regarding the composition of the biofilm matrix, a predominance of proteins was observed in both cases. 3D representations of the architecture of the biofilms revealed an irregular and disorganized distribution of the matrix components.

Subsequently, based on the preliminary results described above, strategies were designed with the aim of preventing and eliminating these biofilms. As a first approach, the antimicrobial effectiveness of several essential oils was evaluated to select the most suitable for use in combination with enzymes. Among the oils evaluated, cassia essential oil proved to be the most effective against L. monocytogenes and S. enterica. In turn, it was determined that the application of subinhibitory doses of cassia essential oil reduced tolerance to the antimicrobial effect in several strains, with L. monocytogenes ST-388 and S. Typhimurium CECT 4594 showing the greatest reductions. Likewise, in general, a limited change was observed in the sensitivity profile of the strains evaluated to antibiotics after exposure to cassia essential oil.

Based on these results, eight treatments combining different enzymes (protease, amylase and mannanase) with cassia essential oil were evaluated to determine the best strategy for removing mature biofilms. The combination of protease, amylase and cassia essential oil was selected as the most effective. Quantitative and qualitative results showed that this treatment achieved reductions in cell counts close to 100%, in addition to breaking up the biofilm architecture.

Finally, as a second strategy, biocontrol was used. The capacity of Bacillus safensis to ecologically replace L. monocytogenes and S. enterica on stainless steel surfaces was evaluated. The presence of preformed biofilms of B. safensis significantly reduced the counts of both pathogens in bispecies biofilms, with L. monocytogenes being the most affected, which makes it a weak competitor against B. safensis.