Association between the degree of immunosuppression measured by nuclear factor of activated T- cells regulated genes and cytomegalovirus infection in lung transplant recipients

Abstract

El trasplantament de pulmó (TP) és l’última opció terapèutica per a pacients amb malalties respiratòries en fase terminal, però presenta l’esperança de vida més baixa entre els trasplantaments d’òrgans sòlids (TOS). L’exposició constant dels pulmons a l’entorn extern augmenta les infeccions, responsables del 37% de les morts durant el primer any després del TP. A llarg termini, el principal obstacle és el desenvolupament de la disfunció crònica de l’empelt pulmonar (CLAD), amb una taxa de mortalitat del 25-30% en els primers 3-5 anys. Aquests problemes estan interrelacionats, ja que les infeccions són un factor de risc conegut per a la CLAD. Determinar la dosi òptima d’immunosupressors és crucial per evitar infeccions i tumors per una immunosupressió excessiva, així com el rebuig agut i la CLAD causats per una immunosupressió insuficient. L’ajustament de la dosi és complicat a causa de l’alta variabilitat interindividual. Actualment, es controlen els nivells mínims de tacrolimus, però aquesta mesura farmacocinètica no reflecteix amb precisió l’estat immunosupressor del pacient. Per això, s’investiguen biomarcadors no invasius i eines farmacodinàmiques per avaluar millor la immunosupressió i el risc d’infecció. El citomegalovirus (CMV) és una infecció oportunista freqüent i clínicament rellevant després del TOS, augmentant el risc de morbiditat i mortalitat. Els seus efectes immunomoduladors incrementen la susceptibilitat a altres infeccions, el rebuig agut i la CLAD. Les taxes de malaltia per CMV en TP oscil·len entre el 8% i el 55%, segons el tipus i durada de la profilaxi antiviral, que és l’estàndard terapèutic. Tot i que la profilaxi redueix el risc d’infecció, el seu ús prolongat pot provocar efectes adversos. Encara que els pacients seropositius es consideren immunitzats, un 25% desenvolupen infeccions i un 15% pateixen la malaltia en els primers 18 mesos després del TP. L’estratificació actual del risc es basa només en marcadors humorals, amb pocs estudis que avaluïn la resposta immune cel·lular específica contra el CMV (CMV-CMI) en receptors de TP (RTP). L’objectiu d’aquesta tesi va ser avaluar dues proves immunològiques prometedores: (1) la mesura de l’expressió gènica residual de tres gens regulats pel factor nuclear de cèl·lules T activades (NFAT) (IL-2, IFN-γ i GM-CSF) i (2) el test ELISPOT per al CMV, per millorar el monitoratge dels fàrmacs immunosupressors en RTP i identificar pacients amb més risc d’infeccions, especialment per CMV. El primer estudi va trobar que els nivells mínims de tacrolimus no es correlacionaven amb el nivell d’immunosupressió mesurat per NFAT-RGE, ni predeien el risc d’infecció o rebuig. En canvi, els nivells màxims de tacrolimus es van correlacionar amb el NFAT-RGE. Un valor de NFAT-RGE <30% es va associar amb un risc més alt d’infeccions bacterianes greus. Per tant, la introducció del NFAT-RGE a la pràctica clínica podria convertir-se en una eina no invasiva valuosa. També es va suggerir la genotipificació dels enzims CYP3A4 i CYP3A5 per identificar metabolitzadors ràpids, amb més risc d’infeccions, i metabolitzadors lents, amb més risc de rebuig. En el segon estudi, el test CMV ELISPOT no va predir de manera fiable quins pacients desenvoluparien infecció per CMV. No obstant això, quan es van utilitzar dos antígens combinats, es va observar que pacients amb una resposta cel·lular feble o intermèdia tenien una taxa d’infecció més alta entre els 6 i els 18 mesos post-TP. Aquells amb una resposta forta tenien un 49% menys de probabilitat de patir una infecció significativa per CMV. En conclusió, aquests estudis contribueixen a la monitorització personalitzada de la teràpia immunosupressora amb tacrolimus i a l’avaluació del risc d’infecció per CMV en pacients de TP, obrint noves perspectives per a futures investigacions.

El trasplante de pulmón (TP) es la última alternativa para pacientes con enfermedades respiratorias en fase terminal, pero sigue siendo el trasplante de órgano sólido (TOS) con menor esperanza de vida. El principal desafío es la disfunción crónica del injerto (DCI), responsable de una alta mortalidad entre tres y cinco años post-TP. Además, las infecciones representan el 37% de las muertes durante el primer año y son un factor de riesgo para desarrollar DCI debido a la constante exposición de los pulmones al ambiente externo. El citomegalovirus (CMV) es una infección oportunista común tras el TOS, que agrava el riesgo de complicaciones como infecciones, rechazo agudo y DCI. A pesar de la profilaxis antiviral estándar, que reduce el riesgo de enfermedad por CMV, persisten riesgos significativos. Las tasas de enfermedad por CMV oscilan entre el 8% y el 55%, según la duración y el tipo de profilaxis. Aunque se asume que los pacientes seropositivos tienen inmunidad, un 25% desarrolla infección y un 15% enfermedad por CMV en los primeros 18 meses post-TP. Actualmente, la estratificación del riesgo se basa en marcadores humorales, mientras que la evaluación de la respuesta inmune celular es limitada. La tesis se centra en mejorar el manejo inmunológico de los receptores de trasplante de pulmón (RTP) mediante dos pruebas inmunológicas: la medición de la expresión génica regulada por NFAT (NFAT-RGE) y el test de ELISPOT para CMV. El objetivo es identificar a los pacientes con mayor riesgo de infecciones y mejorar la personalización de la inmunosupresión. En la primera parte, se evaluó la relación entre los niveles de tacrolimus y NFAT-RGE. Se encontró que los niveles valle de tacrolimus no se correlacionan con la inmunosupresión ni predicen infecciones o rechazo, mientras que los niveles pico sí lo hacen. Valores de NFAT-RGE inferiores al 30% se asociaron con un mayor riesgo de infecciones bacterianas graves, sugiriendo su posible uso como herramienta de monitorización clínica. Además, la genotipificación de los citocromos P450 (CYP3A4 y CYP3A5) podría ayudar a identificar a pacientes con mayor susceptibilidad a infecciones o peores resultados en el injerto, según su capacidad de metabolizar el tacrolimus. En la segunda parte, se evaluó el test de CMV ELISPOT, que mide la respuesta inmune celular específica. Aunque no predijo de manera precisa qué pacientes desarrollarían infección por CMV, sí mostró su utilidad al combinar ambos antígenos analizados. Los pacientes con respuesta celular débil o intermedia frente a CMV presentaron una mayor tasa de infección entre seis y 18 meses después del TP, mientras que aquellos con una respuesta celular fuerte tuvieron un 49% menos de riesgo de infección significativa. Esto permite una mejor evaluación del riesgo, facilitando ajustes en la inmunosupresión y la profilaxis antiviral. En conclusión, los estudios de esta tesis proponen estrategias para personalizar el manejo inmunológico en RTP. La medición de NFAT-RGE podría convertirse en una herramienta no invasiva para ajustar la inmunosupresión, mientras que el test de ELISPOT podría ayudar a valorar el riesgo de infección por CMV en pacientes seropositivos. Estos hallazgos abren nuevas vías para futuras investigaciones clínicas.

Lung transplantation (LT) is the last therapeutic option for patients with end-stage respiratory diseases. Despite advancements, LT has the lowest survival rate among all solid organ transplants (SOT), with 37% of deaths in the first year due to infections caused by the lungs’ exposure to the environment. Chronic lung allograft dysfunction (CLAD) remains the main barrier to long-term survival, causing 25-30% mortality within 3-5 years post-LT. Infections also increase the risk of CLAD, highlighting the need for better post-transplant management. Proper immunosuppressant dosing is critical to balance infection prevention and rejection control. However, due to significant inter- and intra-patient variability, monitoring tacrolimus trough levels remains insufficient for assessing immunosuppressive states. Research is focused on identifying non-invasive biomarkers and pharmacodynamic tools to improve personalized therapy. Cytomegalovirus (CMV) is a significant opportunistic infection after SOT, raising the risk of infections, acute rejection, and CLAD through its immunomodulatory effects. CMV disease rates range from 8% to 55%, depending on prophylaxis duration and type. Universal antiviral prophylaxis, usually given for six to 12 months, reduces CMV disease risk but can cause side effects. Notably, 25% of CMV-seropositive patients still develop CMV infection, and 15% develop CMV disease within 18 months post-LT. Although CMV-specific cellular immune response (CMV-CMI) is essential for infection control, current risk assessment focuses only on humoral markers, leaving a gap in evaluating CMV-CMI in LT recipients (LTR). This thesis aimed to evaluate two promising immunological tests: (1) measuring residual gene expression of three NFAT-regulated genes (IL-2, IFN-γ, and GM-CSF), and (2) using the CMV enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT) test. These tests were designed to improve therapeutic drug monitoring and identify LTRs at higher infection risk, especially for CMV. The first study found that tacrolimus trough levels, currently used for drug monitoring, did not correlate with immunosuppression levels measured by NFAT-regulated gene expression (NFAT-RGE) or predict infection or rejection risk. In contrast, tacrolimus peak levels showed a strong correlation with NFAT-RGE. Importantly, NFAT-RGE values below 30% were linked to a higher risk of severe bacterial infections, suggesting its potential as a non-invasive infection risk assessment tool. Additionally, pre-LT genotyping of cytochromes P450 3A4 (CYP3A4) and P450 3A5 (CYP3A5) could help identify fast metabolizers (FM), prone to infections, and poor metabolizers (PM), at risk of worse graft outcomes due to low tacrolimus levels. The second study assessed the CMV ELISPOT test, which measures CMV-specific immune responses. Although it could not reliably predict which patients would develop CMV infection, its predictive value improved when both antigens were tested together. Among seropositive patients, those showing intermediate (response to one antigen) or weak (response to neither antigen) CMV-CMI had significantly higher infection rates between six and 18 months post-LT. In contrast, patients with strong CMV-specific responses were 49% less likely to develop severe CMV infections. This approach could guide personalized immunosuppression adjustments and CMV prophylaxis modifications. In conclusion, this thesis highlights the potential of NFAT-RGE measurement as a tool for personalized immunosuppressive therapy and the CMV ELISPOT test for assessing CMV infection risk in LTRs. These findings open avenues for further clinical research and improved patient management strategies.